益通网 Microprobes 电极3,4-乙撑二氧噻吩/碳纳米管神经电极涂层在背根神经节刺激中的评估_组织_研究_导电

一、引言益通网

对电响应组织（即大脑、心脏、骨骼肌）进行电刺激已被研究用于多种应用，包括迷走神经刺激、视网膜和耳蜗植入、脊髓刺激以及深部脑刺激。在大多数这些应用中，电极相对较大，输送的电流也相对较高（几百微安到毫安）。相比之下，为微刺激设计的穿透式微电极尺寸较小，输送的电流低得多，并且能使电刺激具有更好的空间分辨率。在神经系统中，空间特异性尤为重要，因为通过刺激可以引发离散且分级的感觉。然而，即使是轻微的组织损伤和瘢痕形成也会影响微电极 - 组织界面的分辨率。此外，微电极的电荷密度较高，电极的退化也是一个需要关注的问题。

在临床环境中，必须在尽量减少组织损伤程度的同时有效激活神经元。在目标激活与组织损伤/电极退化之间合理权衡，对于与电极周围的神经组织保持长期的功能性接触至关重要。然而，这只是导致刺激电极失效的因素之一。由生物相容性问题引发的免疫和炎症反应会阻碍与周围神经组织的功能整合，并导致慢性神经元退化。这些组织反应会对电极性能产生负面影响，通常被称为生物效应。然而，非生物效应（即电极的物理变化）也会影响其电学性能。在电极周围复杂且动态的环境中，这些因素的综合作用可能会导致一系列有害事件。这些事件包括大量瘢痕组织的形成，这会降低电极 - 组织界面处神经元的密度，以及高阻抗层的形成，这会使组织与电极之间的信号转导降至最低。阻抗越高，就需要越大的电流来引发相同的反应，从而导致功耗增加、对电极和周围组织造成更多损伤，并最终降低电极性能。

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确实，许多研究小组都在探索克服这些技术挑战的方法。例如，已经研究了使用高压脉冲来破坏瘢痕组织以及局部输送抗炎药物和神经营养因子。为了解决当前电极材料与脑组织之间的机械不匹配问题，一些研究小组也在研究具有与中枢神经系统或周围神经系统（PNS）组织相似机械性能的软材料。尽管超小电极在组织整合和功能方面已得到证实，但目前还没有一种技术能够完全减轻导致慢性电极性能不佳的生物和非生物效应。此外，微电极很难实现高电荷输送能力。

我们实验室和其他研究团队采用的一种方法是使用导电聚合物对电极进行改性。这些具有生物相容性且本身具有导电性的聚合物是用于神经刺激应用的有吸引力的材料。由于其高离子电导率和较大的电活性表面积，它们表现出快速且高的电荷输送能力，从而导致低阻抗和更有效的电荷转移。在各种导电聚合物中，聚（3,4-乙撑二氧噻吩）（PEDOT）已被证明是用于神经刺激的优秀材料，因为与薄膜铂（Pt）电极相比，它具有卓越的阻抗和电荷注入能力。此外，PEDOT具有改善的电化学、机械和热稳定性，这对于在慢性植入物中使用是必要的。然而，在长时间刺激下，已观察到较厚的PEDOT薄膜会出现分层现象，并且这会受到底层电极表面粗糙度以及掺杂分子的影响。此外，像地塞米松这样的抗炎剂已成功地掺入导电聚合物中并通过电释放来抑制炎症组织反应。然而，仅PEDOT的载药能力有限，在刺激周期中释放的药物量不一致或不可持续，并且药物掺杂薄膜的电学性能也不理想。这些因素凸显了需要改进PEDOT涂层，以实现足够且可重复的药物释放，并改善电学性能。

为了解决这些局限性，最近开发了掺杂碳纳米管（CNT）的聚合物。与掺杂其他物质的PEDOT薄膜相比，CNT/导电聚合物复合材料具有更好的导电性，并且PEDOT/CNT薄膜即使在长时间且强烈的刺激后也表现出改善的稳定性（即无分层或开裂）。此外，碳纳米管具有低毒性、无免疫原性，并且可以作为纳米储库，通过控制药物释放来实现靶向药物输送。例如，负载地塞米松的多壁碳纳米管能够将脂多糖处理引起的小胶质细胞激活程度降低到与外源性给药相似的程度。PEDOT、碳纳米管和地塞米松的组合利用了碳纳米管掺杂剂增加的导电性，并提高了有效储存药物分子的能力，然后通过电刺激以可控的方式释放生物活性药物。

本研究的目的是评估对大鼠背根神经节（DRG）进行刺激对电极阻抗特性和组织反应的影响。然后，我们比较了三种不同涂层条件的效果：未涂层（NC）、PEDOT/CNT涂层（PC）和PEDOT/CNT/地塞米松涂层（PCD）。刺激模式是根据先前的急性研究设计的，用于激活背根神经节中的感觉神经元。这些值也与其他研究人员使用的值一致，这些参数的原理是由其他研究人员在研究中确定的。结果表明，刺激会导致阻抗（Z）值降低，并且与未涂层电极相比，在特定时间点，PC和PCD涂层的电极阻抗Z值更低。此外，与未涂层电极相比，PC和PCD涂层电极的轴突损伤和神经元细胞死亡有所减少。

二、方法

2.1. 双电极制造

双柄微电极是使用一对铂/铱电极（MicroProbes）定制而成的，将其切割成约2.5毫米的长度，柄间间距为100 - 700微米。使用镍铬合金线（聚甲酸酯绝缘，长度约3 - 4毫米）在微电极和经皮导线之间形成中间连接。导线是由聚四氟乙烯绝缘的多股不锈钢线制成的。使用微焊机来连接导线接头。这些导线经硬脑膜下路由至固定在颅骨上的连接件（总体设计如图1所示）。焊接接头用光固化牙科水泥覆盖，然后用一层材料进行绝缘处理。在植入前，对电极进行测试、清洁并使用环氧乙烷（EtO）进行灭菌处理。

图1. 刺激手术的示意图概述。将双电极植入L5或L6的背根神经节（DRG）中。导线从电极处沿着动物背部延伸至固定在颅骨上的适配器。这个头部固定装置允许进行重复刺激，并且包括接地、电极1（1）和电极2（2）的连接。动物每天接受1小时、频率为200赫兹、脉冲宽度为400微秒、电流为20微安的刺激，持续十天，并且使用示波器监测刺激模式。

2.2. 涂层程序

所有用于电极涂层的多壁碳纳米管首先通过强酸处理进行功能化。处理步骤包括将200毫克碳纳米管（外径20 - 30纳米，内径5 - 10纳米，长度10 - 30微米，纯度>95%）与100毫升体积比为1:3的浓硝酸和硫酸通过超声处理2小时进行混合。然后将该溶液在室温下搅拌过夜。通过使用超速离心机用无菌水冲洗碳纳米管溶液来去除酸。当溶液达到中性pH时停止冲洗，收集碳纳米管并在60°C下干燥。

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PEDOT/CNT（PC）和PEDOT/CNT/地塞米松（PCD）涂层均在无菌条件下使用恒电位仪和相关软件进行聚合。使用传统的三电极系统，其中铂（Pt）微电极或双微电极作为工作电极，铂丝作为对电极，银/氯化银（Ag/AgCl）丝作为参比电极。在涂层之前，将探针在磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）中于 - 2V下进行电化学预处理20秒。对于PC涂层，如先前所述，在含有1毫克/毫升碳纳米管的0.02M 3,4-乙撑二氧噻吩（EDOT）水溶液中，以40纳安的恒定电流进行5秒的电聚合。对于PCD涂层，首先将含有20毫克/毫升地塞米松21-磷酸二钠盐和1毫克/毫升碳纳米管的水溶液超声处理1小时，以促进药物加载到碳纳米管中。超声处理后，加入PEDOT使其浓度达到0.02M，按照先前描述的方法，在第一个电极柄上以1.4V聚合30秒，然后在第二个电极柄上以恒定电流聚合30秒。平均电流和电流密度分别为12.4微安和372微库仑/平方微米。PCD电极的电聚合是在含有负载地塞米松的碳纳米管以及游离地塞米松（未负载到碳纳米管中）的水溶液中进行的。因此，PCD涂层是由填充地塞米松的碳纳米管以及游离地塞米松进行掺杂的。

2.3. 电化学阻抗谱（EIS）

使用恒电位仪、FAS2/Femtostat和相关软件，采用三电极系统测量电化学阻抗谱。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，频率范围为0.5赫兹至100千赫兹，使用振幅为5毫伏的交流正弦波，直流电位设置为0伏，并以每十倍频程10个点的频率进行记录。

2.4. 体外药物释放

为了量化在上述刺激参数下释放的地塞米松的量，将PEDOT/CNT/地塞米松涂层沉积在可重复使用的直径为3毫米的玻碳（GC）电极上。首先，将玻碳表面在1.8伏下进行电化学处理250秒，然后使用上述三电极系统，在PBS中以100毫伏/秒的扫描速率，在0.3伏至1.3伏之间进行五个循环的循环伏安法（CV）扫描。使用与微丝相同的溶液，以70微安的恒定电流进行150秒的PEDOT/CNT/地塞米松聚合反应。然后，使用以铂片作为参比电极和对电极的两电极系统对这些电极进行刺激。长达一小时的刺激方案包括施加 - 1.48伏持续200微秒，随后施加0.74伏持续400微秒，并以200赫兹的频率施加到每个电极上。该方案模拟了植入当天在体内使用PEDOT/CNT/地塞米松涂层时观察到的平均电压偏移。每个刺激周期计算地塞米松的释放量。为了量化地塞米松的释放量，将含有释放药物的溶液转移到半面积的96孔紫外（UV）透明检测板中，并在242纳米处测量紫外吸收。

2.5. 手术程序

所有手术程序均按照相关部门概述的程序进行，并得到机构动物护理和使用委员会的批准。动物饲养在相关设施中，可自由获取食物和水。

本研究共使用了14只成年雄性斯普拉格 - 道利大鼠（300 ± 50克）。对于每个刺激组，将3只动物的背根神经节植入未涂层、PEDOT/CNT涂层或PEDOT/CNT/地塞米松涂层的电极。还包括未刺激的对照组（每个涂层1 - 2只动物）（见表1概述）。

表1. 每个处理组中的动物情况。

在手术前，动物用含2.5%异氟烷的0.8升/分钟氧气麻醉5分钟，然后在手术过程中用1 - 2%异氟烷维持麻醉状态。在手术过程中，通过观察呼吸频率、心率、呼出二氧化碳、体温（37.7°C）和足反射消失等变化来密切监测麻醉水平。在动物麻醉期间，将眼药膏涂在眼睛上。

将动物置于立体定位框架中，去除切口部位（头部和背部）的毛发。用异丙醇和聚维酮碘手术擦洗溶液对皮肤进行消毒，并在整个手术过程中保持无菌环境。沿脊柱做一个切口，将皮肤拉开，清除/去除筋膜和组织，以暴露脊柱的尾部。进行单侧椎板切除术，以暴露L5和L6之间背根神经节的左侧。尽量减少植入区域周围肌肉和骨骼的去除和/或切割。暴露后，使用配备真空装置的显微操作器插入双微电极；通过真空将微电极固定在适当位置，通过移动显微操作器进行定位，然后降低到合适位置。导线从动物背部引出，沿头皮做第二个切口，将皮肤拉开以暴露颅骨。用手钻钻孔并拧入骨螺钉，将接地线缠绕在三个螺钉中的两个上。将植入电极的连接器用光敏牙科水泥固定在颅骨上，连接器包括用于连接电极1、电极2和接地的插脚。肌肉和皮肤缝合后，动物在手术室的密切监督下恢复。密切监测大鼠是否有疼痛或不适的迹象，术后疼痛用丁丙诺啡（0.3毫克/千克）处理。所有手术均由同一手术团队进行，以尽量减少与手术和电极植入相关的变异性。

2.6. 刺激方案

在电极植入三天后开始刺激方案，以便动物恢复。对于每个双电极，涂层条件和刺激组保持相同。在刺激组中，使用微刺激系统，在14个研究日中的10天里，每天对电极进行1小时的脉冲刺激，以输送双相电流脉冲，包括先施加200微秒的阴极脉冲，随后是幅度为阴极一半的400微秒阳极相，以保持电荷平衡。接地线放置在两个颅骨螺钉上以及沿着脊髓的硬膜外腔中。阴极相的幅度为20微安，刺激脉冲以200赫兹的速率施加。

为了表征电学性能，使用恒电位仪，以骨螺钉作为参比电极益通网，在200赫兹下产生1001个刺激脉冲序列。使用1000个脉冲来稳定电极电位，消除任何 “棘轮” 效应。在第1001个刺激脉冲时，记录对电流控制的刺激波形的稳态电压响应。测量电极在刺激波形期间经历的最高正电位和最低负电位，并与阻抗进行比较。在电位极限为 - 0.6伏和0.8伏之间，以50毫伏/秒的速度进行循环伏安法（CV）测量。然后通过计算一个完整CV周期内负电流的时间积分来确定电荷存储能力（CSC）。

在每天1小时的刺激期间，动物用盐酸右美托咪定（0.105毫克/千克）进行镇静。根据需要给予维持剂量（0.03毫克/千克）。刺激结束后，用盐酸育马唑仑（0.3毫克/千克）使动物苏醒，并进行监测以确保其行为正常且警觉。对于所有接受刺激的动物，在所有通道上同步连续施加刺激（占空比为100%）。

2.7. 抗体

使用单克隆抗体检测神经丝200 kD（NF200）、波形蛋白（克隆V - 9）和神经元核（NeuN）。使用多克隆抗体检测离子钙结合衔接分子1（Iba1）、L1（由科学家卡尔·拉格纳乌尔博士慷慨赠送）和裂解的半胱天冬酶 - 3（Asp175）。这些抗体以1:500（NF200、Iba1、波形蛋白、L1、NeuN）或1:50（裂解的半胱天冬酶 - 3）的稀释度使用，相应的荧光偶联抗体以1:500的稀释度使用。

2.8. 组织制备和免疫荧光

手术后17天，通过腹腔（IP）注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合剂（100/20毫克/千克）使动物麻醉。然后用冷（4°C）PBS经心脏灌注动物，随后用PBS中的4%（w/v）多聚甲醛（PFA）灌注。取出背根神经节组织，进行长达三天的后固定，然后在30%蔗糖中平衡。取出植入物后，使用最佳切割温度（OCT）化合物对解剖的组织进行冷冻保护。以10微米的厚度进行连续切片。

为了确保评估的界面与导电尖端相对应，对每块组织进行连续切片，直到通过显微镜无法再看到植入部位。这在染色前的切片过程中进行，并在切片和染色后进行确认。在该切片之前的切片用于免疫组织化学。将这些位置与沿电极柄长度的切片进一步比较。使用扫描电子显微镜（SEM）仔细检查取出的双微电极上的组织残留和涂层完整性。在三种涂层条件下取出的每个电极上都能看到一块组织；这些界面被排除在定量分析之外。对涂层微电极的检查显示涂层完整。

为了尽量减少变异性，对每个抗体 - 抗体对的组织切片同时进行染色。使用苏木精和伊红（H和E）染色以及标记物来观察成熟轴突（NF200）、小胶质细胞（Iba1）、星形胶质细胞/成纤维细胞/内皮细胞（波形蛋白）、神经粘附分子（L1）、神经元核（NeuN）和细胞死亡（裂解的半胱天冬酶 - 3）（抗体见表2概述）。

表2. 用于组织学表征的抗体。

将组织切片在PBS中水化，用0.5%牛血清白蛋白（BSA）阻断非特异性结合，然后加入用0.5% BSA稀释的一抗，孵育约1小时。洗涤后，加入用0.5% BSA稀释的荧光偶联二抗（山羊抗小鼠Alexa Fluor 488和山羊抗兔Alexa Fluor 594），孵育约1小时，并使用Hoechst作为核染色剂。使用特定封片剂进行封片并保存荧光。对于每种二抗，都设置了不含一抗的阴性对照。

2.9. 组织定量分析

使用共聚焦荧光显微镜评估与植入电极相关的细胞反应。在相关生物成像中心，使用共聚焦显微镜采集图像。对于每种抗体，使用相同的激光强度和曝光时间采集图像，以减少数据分析过程中的变异性。

为了量化NF200和Iba1的染色情况，使用定制的MATLAB脚本对径向探针进行基于强度的自动分析。对于杀伤区的大小，使用NF200染色的图像，而分析Iba1染色的图像以评估炎症反应随距离的下降情况。杀伤区通过不存在NF200染色的区域来确定，并按照先前描述的方法对该区域进行量化。对于Iba1，确定感兴趣区域的中心，并分析10微米的区域的荧光染色情况。为了使荧光强度标准化，根据在图像角落（四个角落各10%，距离植入物>250微米）测量的像素强度计算背景噪声强度阈值。强度比平均像素强度暗一个标准差以上的像素被视为 “信号”，并从强度本底噪声计算中去除。然后通过计算剩余强度本底噪声像素强度平均值以下一个标准差的像素强度来确定强度阈值。计算并比较观察到Iba1强度峰值的距离。对于NeuN/半胱天冬酶 - 3染色的图像，对NeuN/半胱天冬酶 - 3阳性细胞的数量进行量化，并以占总NeuN阳性细胞的百分比报告。

2.10. 统计分析

使用相关软件进行统计分析。除非另有说明，治疗组之间的比较采用双向方差分析（ANOVA），然后进行Bonferroni事后分析。p值≤0.05被认为具有统计学意义。

三、结果

尽管背根神经节（DRG）是记录或刺激初级传入神经元以提供感觉反馈的理想部位，但缺乏研究刺激引起的组织反应的相关研究。为了进一步研究这个外周部位，我们将双柄微电极植入成年大鼠体内，并在两周时间内让动物接受每日刺激方案。在这些研究中，将电极植入L5或L6的背根神经节中，导线连接到动物颅骨上的适配器，以便进行重复刺激（每组动物情况见表1）。所采用的刺激模式基于先前在猫大脑皮层中的实验方案，我们的研究方法概述如图1所示。

3.1. 涂层形态

在制造双微电极后，对电极表面进行了两种改性中的一种。第一种，如先前所述，在电聚合过程中，将经过酸预处理的碳纳米管（CNT）掺杂到聚（3,4-乙撑二氧噻吩）（PEDOT）主链中。在得到的PEDOT/CNT（PC）涂层中，碳纳米管分散良好，并形成了类似网络的结构（图2（B），（D）），这与其他研究人员观察到的不同。对于第二种涂层，在将地塞米松与3,4-乙撑二氧噻吩（EDOT）单体混合之前，先将地塞米松与碳纳米管进行超声处理，以促进地塞米松加载到碳纳米管中，从而制备出PEDOT/CNT/地塞米松（PCD）涂层（图2（C），（E））。尽管未涂层电极的基底粗糙且不均匀，但两种涂层总体上是均匀的，并且表面呈现出纳米纤维形态，比未涂层（NC）对照组的孔隙更多（图2（A））。

图2. 电极涂层。未涂层（NC）（A）、PEDOT/碳纳米管（PC）（B）、（D）以及PEDOT/碳纳米管/地塞米松（PCD）（C）、（E）电极的扫描电子显微镜（SEM）图像。比例尺表示1微米。

3.2. 体外电学性能

与未涂层电极相比，PC涂层在所有频率下的体外阻抗都显著更低，而PCD涂层在1千赫兹左右及以下频率具有中等阻抗值（图3（A））。PCD膜的中等阻抗可归因于游离地塞米松的额外掺杂，已有研究表明，这种掺杂会使膜的阻抗降低幅度较小。相位图也显示出每组的不同行为（图3（B））。对于未涂层电极，相位在较低频率下表明其具有更多的电容特性，并且随着频率增加，趋向于更多的电阻特性。PC涂层在低频（<100赫兹）下表现出纯电容特性，随后随着频率增加变得更具电阻性。PC涂层显著更大的有效表面积导致其电容更高，使得与裸金属电极相比，在低得多的频率下其主要阻抗屏障就是电阻性的。在PC和PCD电极之间观察到的差异可能是由于PCD膜中游离地塞米松的共掺杂。游离地塞米松的掺入通过占据聚合物主链上本可被电学性能更优的碳纳米管填充的位点，降低了聚合物涂层的孔隙率和电导率。

图3. 未涂层（NC）、PEDOT/碳纳米管（PC）和PEDOT/碳纳米管/地塞米松（PCD）条件下的体外阻抗谱。（A）波特图。PEDOT/碳纳米管（PC）涂层（实心正方形）观察到最低的阻抗（Z）值，并且地塞米松的掺入使得PEDOT/碳纳米管/地塞米松（PCD）涂层（实心三角形）的阻抗谱更类似于未涂层（NC）（实心圆形）所观察到的阻抗谱。（B）相位图，表明未涂层（NC）（实心圆形）、PEDOT/碳纳米管（PC）（实心正方形）和PEDOT/碳纳米管/地塞米松（PCD）（实心三角形）涂层的不同电极 - 电解质界面行为。每个图包含来自n = 3个重复的数据，误差条表示标准差（SD）。（C）体外地塞米松释放总量。在体内研究过程中施加的十次刺激中，地塞米松通过电刺激释放（实心正方形）。电刺激引发的药物释放量显著多于（p < 0.0001）被动扩散所观察到的释放量（实心圆形）。

3.3. 体外药物释放

体外研究用于评估作为刺激次数函数的地塞米松释放量。使用在体内采用的长达一小时的刺激方案对电极进行十次刺激，并与在相同时间段内让等效电极扩散到溶液中的情况进行比较。刺激组和未刺激组样品在第一次刺激后，平均释放量分别为每平方厘米10.9微克地塞米松和每平方厘米5.4微克地塞米松。在初始释放后，刺激组和未刺激组样品每次释放的平均量分别为每平方厘米2.3微克地塞米松和每平方厘米0.9微克地塞米松。经过十次刺激后，每平方厘米总共释放了31.4±4.9微克地塞米松，而仅通过扩散总共释放了每平方厘米13.0±1.5微克地塞米松。使用瞬时源扩散模型和地塞米松在脑组织中的扩散系数，确定了刺激一天后在植入物500微米范围内地塞米松的平均浓度。初始释放刺激导致平均浓度为14.5微摩尔，随后的释放导致释放一天后在植入物500微米范围内平均浓度为3微摩尔。先前的研究表明，地塞米松在一定浓度范围内能够减轻神经植入物周围的炎症反应，这表明在本研究过程中，对PCD涂层电极长达一小时的刺激会释放出具有生物学意义量的地塞米松。此外，体外数据显示，在十次施加的释放过程中，刺激后的药物释放曲线没有出现平台期，这表明仍有药物可供释放。需要注意的是，这是基于脑组织的理论估计；背根神经节中的扩散情况会与脑组织中的不同，但这个数值尚未确定。此外，由于背根神经节的异质性（即电极放置在细胞体附近与放置在轴突附近），预计电极位点之间会有更大的变异性。

3.4. 体内电极性能

在体内研究中，对未刺激和刺激的电极都采取了一些测量措施。首先，确定了刺激对1千赫兹下阻抗（Z）值的影响。经过刺激，所有涂层和未涂层电极在1千赫兹下的Z值都显著降低（103.3±2.7千欧对比64.8±2.2千欧，图4（A）；p<0.001）。然后评估了不同涂层条件下Z值随时间的潜在变化。在未刺激的情况下，三种涂层条件之间的Z值没有显著差异（图4（B））。此外，在未刺激的情况下，任何一种涂层条件的Z值都没有统计学上的显著变化（数据未显示）。然而，在刺激的情况下，PC涂层电极（图4（C）；第1至3天p<0.05，65.3±6.8千欧）和PCD涂层电极（图4（C）；第1至3天p<0.05，58.4±7.3千欧，第4至7天，53.9±4.2千欧）的Z值显著低于未涂层电极的Z值（第1至3天，86.5±6.9千欧，第4至7天，77.7±5.3千欧）。PCD涂层的Z值更持久地降低，可能是地塞米松反复释放的结果，地塞米松的释放可以减轻组织炎症，并间接影响Z值。

图4. 体内1千赫兹下的电极阻抗（Z）。（A）经过刺激，当所有涂层条件合并时，1千赫兹下的Z值显著降低。误差条表示标准误（SEM）。（B）在研究中，1千赫兹下的阻抗值根据涂层条件和时间点进行分组。对于未接受刺激的电极，在不同涂层和时间点之间未观察到显著差异。误差条表示标准误（SEM）。（C）1千赫兹下的阻抗值根据涂层条件和刺激天数进行分组。与未涂层（NC）对照组相比，PEDOT/碳纳米管（PC）涂层（第4至7天）和PEDOT/碳纳米管/地塞米松（PCD）涂层（第1至3天和第4至7天）观察到阻抗（Z）值在统计学上显著降低。误差条表示标准误（SEM）。（D）阻抗与正电位和负电位之间的相关性。*p < 0.05；***p < 0.001。

然后评估了Z值与电极最大电位（电极在刺激期间经历的最高正电位和最低负电位）之间的相关性，以确保我们的刺激和Z值测量是有效的（图4（D））。皮尔逊相关测试结果表明，Z值与正电位（p<0.001；R² = 0.4323）和负电位（p<0.001；R² = 0.5604）都相关。这种相关性强调了较低Z值的好处。也就是说，较低的电极电位对组织和植入电极来说都更安全。

最后，获取并比较了体内不同涂层条件下的循环伏安法（CV）测量结果（图5）。给出了三种涂层条件在体内第1至3天、第4至7天和第8至10天的代表性CV响应。

图5. 植入电极的电学特性。给出了三种电极涂层在体内第1至3天（顶部）、第4至7天（中间）和第8至10天（底部）的循环伏安图。来自未涂层（NC）（黑色）、PEDOT/碳纳米管（PC）涂层（蓝色）和PEDOT/碳纳米管/地塞米松（PCD）涂层（红色）代表性电极的循环伏安图进行了平均，平均值用实线表示。阴影区域表示标准差（SD）。

3.5. 组织反应

进行了一些组织学染色，以表征对未涂层（NC）、PC涂层和PCD涂层电极的组织反应（抗体见表2概述）。首先，为了确定植入部位周围神经元和轴突的损失程度，使用了神经丝200 kD（NF200）抗体。在植入部位紧邻的区域，NF200染色减少或缺失（图6（A））。使用MATLAB对这个杀伤区的大小进行量化和比较。与PC涂层电极（64.7±32.1微米；图6（B）；p<0.001）或PCD涂层电极（66.4±25.5微米；图6（B）；p<0.001）相比，未涂层电极的杀伤区大小显著增加（119.1±42.2微米）（所报告的值为平均值±标准差）。

图6. 刺激后背根神经节（DRG）中神经丝200（NF-200）和离子钙结合衔接分子1（Iba-1）的表达。对大鼠背根神经节进行神经丝200（NF200，红色）和离子钙结合衔接分子1（Iba1，绿色）染色的免疫荧光图像。在植入部位紧邻的区域缺乏神经丝200（NF200）染色，并且通过测量该染色缺失区域的大小来评估差异。离子钙结合衔接分子1（Iba1）阳性细胞定位在植入部位周围，并且对这种增加的免疫反应性进行量化和比较。（A）给出了刺激后每种涂层条件的代表性图像。（B）根据涂层条件比较杀伤区大小，与未涂层电极相比，涂层电极观察到杀伤区大小显著减小。（C）离子钙结合衔接分子1（Iba1）染色强度作为距电极 - 组织界面距离的函数。使用分析图像的角落定义背景染色。基于每个图像的背景染色建立阈值，并且测量高于该阈值的离子钙结合衔接分子1（Iba1）染色作为距植入部位距离的函数。在10微米的区域中计算中位强度值，并以平均值±标准误（SEM）报告。比例尺表示100微米。*p < 0.05；***p < 0.001。

我们还试图分别使用离子钙结合衔接分子1（Iba1）和波形蛋白抗体来表征一些非神经元细胞反应，包括与小胶质细胞/巨噬细胞和成纤维细胞相关的反应。Iba1染色呈阳性的细胞定位在植入部位紧邻的区域；在植入部位或其附近染色强度最高，并且离这个界面越远染色强度越低（图6（A））。使用定制的MATLAB脚本将这种强度变化作为距离的函数进行量化，结果如图6（C）所示。无论涂层条件如何，Iba1强度最初增加，然后在离界面更远的地方下降到背景水平。未涂层、PC涂层和PCD涂层电极的Iba1强度峰值分别出现在大约35.0微米（3.5±0.3）、45.0微米（2.5±0.3）和25.0微米（2.8±0.3）处。与未涂层电极相比，在15微米、25微米、35微米（p<0.001）和85微米（p<0.05）的距离处，PC涂层电极的Iba1强度有统计学上的显著降低。

波形蛋白免疫反应性在整个组织中相对均匀，这表明植入电极和慢性刺激对波形蛋白阳性细胞（包括内皮细胞和巨噬细胞）没有引发明显的影响（图7）。进行了跨膜细胞表面糖蛋白L1的染色，在界面周围观察到L1免疫反应性增加，而在离这个界面更远的地方是背景水平（图7）。

图7. 刺激后背根神经节（DRG）中L1和波形蛋白的表达。在植入未涂层（NC）、PEDOT/碳纳米管（PC）和PEDOT/碳纳米管/地塞米松（PCD）神经探针后，对大鼠背根神经节进行L1（绿色）和波形蛋白（红色）染色的免疫荧光图像。在植入部位周围发现L1染色，并且与施万细胞/外周髓鞘相关。波形蛋白染色相对均匀分布，与L1有一些共定位。给出了刺激后每种涂层条件的代表性图像。比例尺表示100微米。

最后，为了确定对神经元细胞死亡的影响，确定了神经元核（NeuN）和活化的半胱天冬酶 - 3的共定位情况（示例图像见图8）。与未涂层对照组相比，通过NeuN/半胱天冬酶 - 3阳性细胞数量与NeuN阳性细胞数量的比例评估，PC涂层和PCD涂层电极都与神经元细胞死亡百分比的降低相关（表3）。

图8. 背根神经节（DRG）中神经元核（NeuN）和活化的半胱天冬酶 - 3的共定位。使用免疫荧光图像来确定神经元核（NeuN，红色）和裂解的半胱天冬酶 - 3（绿色）之间的共定位程度，并给出代表性图像。对神经元核/半胱天冬酶 - 3（NeuN/caspase-3）阳性细胞的数量进行量化，并以占神经元核（NeuN）阳性细胞总数的百分比报告。给出了三种涂层条件中每种条件的代表性图像。比例尺表示100微米。

四、讨论

像背根神经节这样的周围神经系统（PNS）部位是植入长期神经接口或神经假体的潜在位置。在本研究中，我们评估了未涂层铂/铱（Pt/Ir）电极以及用导电聚合物改性的电极在受到刺激时的细胞反应。我们的结果表明，在存在PC和PCD表面改性的情况下，电极性能和神经元健康状况得到了显著改善。

在体外观察到涂层电极的阻抗值较低。对于未进行刺激方案的电极，在体内没有观察到这些差异。在这个复杂的微环境中，除了涂层之外的其他因素也会影响测量的阻抗值，并且可能会抵消在体外观察到的有益效果。在体内早期（第1至3天；PCD与未涂层相比）和中期（第4至7天；PC和PCD与未涂层相比）的时间点，观察到涂层电极的阻抗值降低；然而，在后期时间点（第8至10天）没有观察到统计学上的显著差异。与PC涂层相比，PCD涂层观察到的阻抗降低表明药物释放具有有益效果，尽管这些效果的长期影响尚不清楚。需要进行更长期的研究（>四周），以确定早期的益处是否会转化为改善的慢性电极 - 组织界面。虽然这项体外和早期慢性体内研究展示了用于药物释放刺激电极的概念验证平台，但最近的研究表明，植入后的前12小时至21天可能是最具动态性且对旨在促进长期功能的干预措施最有用的时期；在此期间持续释放地塞米松可能尤为重要。此外，可能需要超小电极将早期益处扩展到长期性能。

在像背根神经节这样的外周组织中，据信免疫细胞在损伤后会侵入，并且一些小胶质细胞/巨噬细胞会表达Iba1。使用这个标记物作为炎症反应的指标，我们的结果表明，与未改性的电极相比，用导电聚合物改性的电极的炎症反应较小。然而，当比较PCD涂层电极和未涂层电极时，在Iba1强度方面没有观察到显著差异。这与有和没有地塞米松的硅神经探针所获得的结果相似，并且可能是由于药物耗尽或如先前所提出的炎症反应的稳定化。

为了评估局部地塞米松释放的效果，比较了PC涂层和PCD涂层电极。尽管PCD涂层的神经元细胞死亡总量比PC涂层低（14.1%对比19.7%），但在杀伤区半径方面没有观察到显著差异。科学家钟和贝拉蒙孔达在大脑中也得到了类似的结果；在植入后一周和四周，用地塞米松涂层的硅神经探针观察到更多的神经丝160（NF160）染色。关于炎症反应，PC涂层的Iba1强度峰值出现在离植入部位比PCD涂层更远的地方（45.0微米对比25.0微米）。尽管地塞米松存在时Iba1强度较高的区域，但PCD涂层的总体炎症面积较小。这与证明地塞米松抑制免疫反应能力的研究结果一致。尽管在这个相对短期的研究中预计不会出现瘢痕形成，但地塞米松也已被证明对这一相关过程具有抑制作用。其他药物或它们的组合可能被证明在控制免疫反应和神经胶质细胞活化方面更有效；当然，组合方法对于促进神经突生长是有效的。然而，本文呈现的结果提供了证据，表明这个平台可以用于在体内以可控、局部的方式加载和释放治疗剂。

为了确保涂层本身不会引发被电刺激抑制的意外组织反应，比较了有刺激和无刺激情况下的阻抗值和细胞反应。通过刺激，我们观察到阻抗随着时间降低，这与其他研究人员短暂观察到的情况一致。从组织学角度来看，这种较低的阻抗与神经元健康状况的显著改善相关。本研究是首次在体内评估PC和PCD涂层的性能。尽管每个涂层的无刺激对照组仅包括1至2只动物，但我们能够确保涂层本身不会引发大规模的组织反应。

在比较涂层电极和未涂层电极时，观察到聚合物涂层的杀伤区更小，并且神经元细胞死亡量不到未涂层时观察到的一半。同样，与未涂层电极相比，改性电极的炎症程度降低。尽管电极 - 组织界面的复杂性使得难以确定简单的因果关系，但对于给定的刺激方案，较低阻抗的电极（即那些具有导电聚合物涂层的电极）所经历的电压较低。这种降低的电位不仅会影响电记录特性，而且应该会对组织造成较少的损伤。在后续包括多个时间点的研究中，可以进一步研究这些因素之间的相互作用以及这些相互作用发生的时间尺度。

虽然我们实验室之前已经研究过聚吡咯（PPy）/CNT/地塞米松和PEDOT/CNT，但本研究是首次报道PEDOT/CNT/地塞米松涂层。这种新型涂层结合了PEDOT的稳定性和碳纳米管的载药能力，可将抗炎剂直接输送到电极 - 组织界面。所采用的刺激方案是仿照用于视觉假体装置的皮质内微刺激以及感觉运动皮层刺激的方案设计的，并且与先前研究中使用的方案不同。虽然将限制组织损伤程度仍然是首要任务，但可以研究更强的刺激或更厚的涂层，以实现更大的药物释放或加载量。尽管为了防止电荷积累，功能应用中更倾向于电荷平衡的方案，但最佳的药物释放可能需要更大的负偏压或以更低的频率进行给药。此外，更紧密匹配目标组织机械性能的电极应该能够最大限度地减少由微运动和/或异物反应引起的与不匹配相关的损伤，这一点也必须加以考虑。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，在神经系统损伤后会发生，并且可以由多种损伤因素触发，这些因素会导致细胞凋亡性死亡，包括那些影响远离界面的细胞的因素（即细胞因子、炎症、兴奋性毒性和自由基损伤）。我们的涂层电极似乎减少了这种继发性损伤机制。同样，涂层电极观察到的较小杀伤区大小表明这些电极促进了神经元和轴突的存活。这些发现与先前研究地塞米松释放的工作一致，在该研究中，在植入后一周和四周的时间点观察到神经元损失减少。

对于每种涂层条件下的一个植入物，存在一个受损的界面，在这个界面处无法看到两个电极的位置。相反，观察到一个较大的界面（示例图像见补充图）。这可能是由于电极尖端弯曲导致组织与电极一起被移除。对于这种组织反应变异性的另一种可能解释是植入物对关键血管结构的损伤程度。对于未来的应用，更准确地靶向神经根将是有价值的。此外，可以评估这些涂层对诸如记录质量和信号漂移等参数的影响。

在当前的研究中，在植入电极周围发现了强烈的L1染色。已有研究表明，在体外和体内，神经系统损伤后L1会上调。这种上调被认为可以促进神经修复和再生。例如，在帕金森病小鼠模型和脊髓损伤模型中，L1已被证明可以提高细胞存活率。PC涂层和PCD涂层电极的L1免疫反应性增加可能表明植入部位附近受损神经元或轴突的再生，因为L1介导外周髓鞘的形成。在大量神经元丢失或退化的情况下，L1的表达可能表明附近健康神经元的代偿性发芽。需要进一步的研究来更好地理解L1的作用，特别是在周围神经系统中的作用。目前，我们认为L1可以作为损伤后再生反应的可靠标记物；它不一定表明功能恢复，但表明损伤/修复级联的激活。然而，通过适当的信号，有可能促进/增强这种固有的再生能力以恢复完整功能。

本研究是首次在涉及刺激的体内模型中报道PC和PCD涂层。研究表明，与未涂层电极相比，抗炎剂的可控和局部释放可以最大限度地减少与炎症反应相关的总体区域，并维持神经元健康。PEDOT的高稳定性与碳纳米管的载药能力相结合，值得进行更多的测试和优化，以在电极 - 组织界面实现长期稳定性。

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